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本试剂盒采用茎环结构的逆转录引物与miRNA分子的3’端结合，并在逆转录酶的作用下进行反应，获得人为加长的miRNA第一链cDNA。获得的逆转录产物可直接用于后续的染料法或探针法荧光定量检测。此方法特异性高只对成熟的miRNA进行反转，不受其前体干扰，序列高度同源的miRNA也可精确区分。2×浓缩的预混溶液和预混酶使用更方便，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染。

• 特异性的茎环引物，只对成熟的miRNA进行反转，不受其前体干扰，序列高度同源的miRNA也可精确区分。
  
• 逆转录效果更好，检测更灵敏。
  
• 适用于染料法和探针法检测。
  
• 2×浓缩的预混溶液和预混酶使用更方便。

• 所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
  
• 避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。长期保存可置于-20℃。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。
  
• 使用过程中应避免RNase污染。
  
• 反应液配制请在冰上进行。

• miRNA茎环引物及realtime-PCR引物设计方法：
  
  • stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。通用茎环结构序列为：
    GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC
    例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后加上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT
    
  • realtime上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60℃。因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4℃。
    
  • 下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
    
  • 引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（产物长度很短，需要3%以上的琼脂糖胶）。
• 茎环法反转录反应
  
  • 在冰浴的离心管中加入如下反应混合物：
    

    成分	用量
    2×miRNA L-RT Solution mix	10μL
    miRNA L-RT Enzyme mix	1.5μL
    Total RNA/micro RNA	3～4μg/200ng
    Stem-loop primer(10μM)	1μL
    RNase-free water	至20μL

    
    
  • 轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物16℃温浴30min，然37℃温浴30min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存。
    
  • 获得的cDNA反应液可直接作为模板进行荧光定量检测。